上海某養(yǎng)雞場的一肉雞群，28日齡時(shí)，出現(xiàn)呼吸道癥狀，雞群中可聽到明顯的呼吸道啰音。雞呼吸困難，鼻腔內(nèi)有黏液，出現(xiàn)少量死亡。食欲下降，發(fā)病前期日飼料量減少30％，以后有所恢復(fù)。剖檢：病雞氣管分泌物增多；肺臟充血、出血，炎性分泌物明顯；食、腺胃未見明顯病變，嗉囊有積液；肝臟、脾臟和腎臟均無明顯病變，直腸見有少量出血，盲腸扁桃體有鮮紅色出血斑。雞群發(fā)病初期，抗生素治療病情不見好轉(zhuǎn)。病程長達(dá)2周多，發(fā)病3d～4d時(shí)，雞群死亡率最高，但不到1％，整個(gè)發(fā)病期間，死亡率在5％以下。但雞群生長速度受到較大的影響，生產(chǎn)性能下降。
從上述情況，難以對本病做出明確診斷。為此，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1采集病料
采集雞群發(fā)病3d～4d后的病料。其一，用棉簽采集病雞鼻腔和氣管的黏液，放入滅菌瓶中。其二，采集病雞的病變肺臟。
1.1.2試驗(yàn)試劑
新城疫(ND)標(biāo)準(zhǔn)抗原，ND標(biāo)準(zhǔn)血凝抑制抗體(HI)，由哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)。
禽流感標(biāo)準(zhǔn)抗原(H5、H9)，配套的標(biāo)準(zhǔn)HI抗體，由哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)。
普通營養(yǎng)瓊脂，實(shí)驗(yàn)室自己制備。
1.1.3試驗(yàn)設(shè)備
恒溫恒濕培養(yǎng)箱(型號LHS-250SC，上海一恒科技有限公司)、離心機(jī)(型號80-1，上海手術(shù)器械廠)、96孔血凝板、微量移液器、滅菌一次性注射器、研缽、濾菌器和0.22μm濾膜等。
1.2試驗(yàn)方法
⑴病料棉簽瓶中加滅菌生理鹽水5mL，凍融3次，2000r/min離心，取上清液濾菌器除菌。病雞的病變肺臟剪碎，放入消毒的研缽中研磨。研磨過程中，凍融3次，并按常規(guī)加抗生素抑菌。
⑵上述處理的病料分別接種9日齡的雞胚，對照組接種滅菌生理鹽水。孵化24h，照胚后去除死亡的雞胚。分別在孵化48h和96h后，收取雞胚尿囊液。同時(shí)觀察雞胚的病變。
⑶對收取的尿囊液進(jìn)行菌檢和血凝性檢查。菌檢陰性的尿囊液做第二代接種。按上述操作再進(jìn)行第三代接種。對有血凝性的尿囊液進(jìn)行血凝抑制(HI)試驗(yàn)，分別以ND標(biāo)準(zhǔn)血清，禽流感H5、H9、H7標(biāo)準(zhǔn)血清按常規(guī)進(jìn)行HI試驗(yàn)。
⑷根據(jù)傳染性支氣管炎病毒能耐受pH2酸度而新城疫病毒不能的特性，分別在雞胚有病變而沒有血凝性和有血凝性的尿囊液中，加入鹽酸，使其終濃度達(dá)1％，37℃作用1h。之后，接種雞胚。對照組接種1％濃度的鹽酸。
⑸收取上述處理后孵化的雞胚尿囊液，再傳一代。檢測尿囊液的血凝性同時(shí)觀察雞胚病理病變。雞胚出現(xiàn)典型IB病變，尿囊液沒有血凝性的，即為去除ND病毒的傳染性支氣管炎病毒液。
⑹血凝干擾體外試驗(yàn),以病料分離時(shí)，有血凝性的雞胚尿囊液1︰1加入去除ND病毒的傳染性支氣管炎病毒液，混合后，做血凝性試驗(yàn)。同時(shí)，以Lasota新城疫疫苗病毒株同樣加入上述IB病毒液進(jìn)行血凝性檢測。
⑺血凝干擾體內(nèi)試驗(yàn)，先于9日齡的雞胚中，接種上述HCl處理的傳染性支氣管炎病毒，孵化18h，再接種分離的ND病毒株。Lasota新城疫疫苗病毒株按同樣方法接種。對照組為新分離的ND病毒株和Lasota新城疫疫苗病毒株。接種后分別于48h和72h，收取尿囊液，檢測各組尿囊液血凝效價(jià)。
2結(jié)果與分析
2.1病毒分離情況見
病料接種雞胚后，棉簽病料經(jīng)離心、濾菌處理的，沒有污染，而病料肺臟研磨后，加抗生素抗菌的效果不佳，24h時(shí)照胚，胚液渾濁，收取尿囊液菌檢，有菌。48h后雞胚全部死亡，表明常規(guī)用青鏈霉素抑菌已經(jīng)不能達(dá)到試驗(yàn)要求。用離心濾菌的方法效果理想。病毒分離情況見表1。
試驗(yàn)結(jié)果表明，對照組雞胚生長正常，尿囊液檢測沒有血凝性。
2.2同群病雞中不同的病料分離病毒的結(jié)果
2.2.1病料1分離病毒結(jié)果
病料1經(jīng)二代雞胚接種，沒有檢測到血凝性。但雞胚孵化4d后，第一代雞胚出現(xiàn)與對照組相比胚體發(fā)育不良，剖檢見雞胚輸尿管尿酸鹽沉積。第二代出現(xiàn)明顯的侏儒胚病變，雞胚腎臟呈雪花樣尿酸鹽沉積。表現(xiàn)出較典型的傳染性支氣管炎病毒感染癥狀(圖1)。
2.2.2病料2分離病毒結(jié)果
病料2經(jīng)二代雞胚接種，第一代有50％的雞胚出現(xiàn)血凝性，血凝效價(jià)達(dá)26～28。以有血凝性的雞胚尿囊液傳第二代，孵化48h血凝效價(jià)達(dá)210～212，96h血凝效價(jià)穩(wěn)定在210～213。用已知ND標(biāo)準(zhǔn)血清和禽流感H5、H7、H9標(biāo)準(zhǔn)血清，按常規(guī)以HI試驗(yàn)鑒定病毒結(jié)果見表2。
從試驗(yàn)結(jié)果判斷，分離的有血凝性病毒是新城疫病毒。
2.3鹽酸去除新城疫病毒的試驗(yàn)結(jié)果
以HCl處理的病毒分離液，接種雞胚為F1代，收取尿囊液，不加鹽酸再接種雞胚為F2代。試驗(yàn)結(jié)果見表3。
試驗(yàn)結(jié)果表明，病料1經(jīng)HCl處理后，經(jīng)雞胚接種二代，出現(xiàn)典型的IB癥狀，與未處理的病變表現(xiàn)沒有明顯變化。病料2經(jīng)HCl處理后，血凝性消失。雞胚表現(xiàn)出典型的IB癥狀，說明新城疫病毒已經(jīng)去除。
2.4傳染性支氣管炎病毒對新城疫病毒的血凝干擾試驗(yàn)結(jié)果
2.4.1體外試驗(yàn)結(jié)果
體外試驗(yàn)是直接將二種病毒按1︰1混合，對照組為單一的病毒液按1︰1加入生理鹽水。檢測血凝效價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果見表4。
試驗(yàn)結(jié)果表明分離的IB病毒對分離的ND病毒的血凝性有一定的干擾，但不明顯。對新城疫疫苗病毒的血凝性沒有干擾作用。從試驗(yàn)結(jié)果分析，直接的體外干擾試驗(yàn)不能說明其干擾作用。
2.4.2體內(nèi)干擾試驗(yàn)結(jié)果
按常規(guī)傳染性支氣管炎病毒雞胚體內(nèi)干擾試驗(yàn)結(jié)果見表5。試驗(yàn)結(jié)果表明分離的IB野毒對分離的ND野毒有明確的血凝干擾作用，而對新城疫疫苗Lasota毒株的血凝干擾作用不明顯。
3討論
在此病例中，同群病雞的不同病料經(jīng)接種雞胚分離病毒時(shí)，病料1僅分離出傳染性支氣管炎病毒，而接種病料2的雞胚中，IB病毒和ND病毒都有生長。在診斷此病例時(shí)，正是由于接種病料的雞胚中只出現(xiàn)IB的典型癥狀，而沒有血凝性，才提示在有血凝性的分離病料中可能還存在沒有血凝性的IB病毒。后經(jīng)酸處理有血凝性的雞胚分離液，證實(shí)了有些采集的病料中存在二種病毒。
禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎等雞的傳染病，在臨床表現(xiàn)上都有呼吸道癥狀，很多時(shí)候僅憑臨床癥狀難以做出明確診斷。通過實(shí)驗(yàn)室分離病毒再進(jìn)行病毒鑒定是最確實(shí)的診斷途徑。但是在對病毒混合感染進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷時(shí)，有血凝性的病毒由于檢測方便，鑒定也容易，可能忽視了沒有血凝性的病毒混合在其中，導(dǎo)致診斷不全面。為避免此現(xiàn)象，除進(jìn)行血凝性檢測外，要注意觀察接種雞胚的病變，防止漏檢IB病毒。更好的方法是研究能檢測多種病毒(癥狀相似)的多重PCR方法，以防止漏檢。
本病例分離的ND病毒株血凝性受到IB病毒的明顯干擾，其特性與新城疫B1株(新城疫Ⅱ系疫苗)類似。查詢本群雞用于預(yù)防新城疫接種的疫苗，均為lasota毒株，并未使用過新城疫Ⅱ系疫苗，因此表明分離的ND病毒是具有新城疫B1株特性的野毒，致病力不強(qiáng)。一般分離IB病毒，要在雞胚中傳代3～5代，才能出現(xiàn)明顯的侏儒胚癥狀。而本病例中，只傳了二代，就出現(xiàn)明顯侏儒胚現(xiàn)象，提示本次分離的傳染性支氣管炎病毒毒力可能毒力較強(qiáng)。
本病例中，有的病雞病料中僅含有IB病毒，有的含有IB、ND二種病毒，但在臨床癥狀上沒有顯著差別。發(fā)病雞群從臨床表現(xiàn)來看，死亡率不高，但病程較長，可能提示新城疫和傳染性支氣管炎混合感染，導(dǎo)致二種病毒相互干擾，降低了病毒(尤其是傳染性支氣管炎病毒)對雞體的毒力。但是，可能由于病毒相互作用，使機(jī)體抗感染的免疫力不能正常產(chǎn)生，臨床表現(xiàn)為病程延長。
根據(jù)本病例做出的診斷，養(yǎng)雞場在以后的肉雞飼養(yǎng)時(shí)，調(diào)整了傳染性支氣管炎和新城疫的免疫程序和所使用的疫苗，有效地防止了傳染性支氣管炎和新城疫的發(fā)生。
(上海旺園家禽養(yǎng)殖專業(yè)合作社，陳印權(quán)；上海申浦家禽育種有限公司，徐敏，錢偉；上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，吳祖立，馬犇，費(fèi)政)
