多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，PM)對雞、鴨、鵝、野禽、豬、牛、羊、馬、兔等均可致病。急性型呈出血性敗血癥，迅速死亡;亞急性型于黏膜關(guān)節(jié)等部位發(fā)生出血性炎癥等;慢性型則表現(xiàn)為皮下組織、關(guān)節(jié)、各器官的局灶性、壞死性炎癥等。豬瘟為一種急性或慢性、熱性和高度接觸性傳染病，以高熱稽留和小血管變性引起的廣泛出血、梗塞和壞死為主要特征，不分年齡、性別、體重大小，也不分季節(jié)均可染病，患病豬只抗病力降低，極易引起繼發(fā)感染。由豬瘟病毒感染引起巴氏桿菌的繼發(fā)感染會對豬機體造成嚴重損傷。
1發(fā)病情況
重慶市某豬場保育豬發(fā)生嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，以咳嗽、稽留熱、食欲減退為主，逐漸消瘦、腹瀉。經(jīng)抗生素治療后癥狀減輕，2～3d后又復發(fā)，嚴重病例4～6d死亡，發(fā)病率35%，死亡率30%，場主疑為病毒感染，遂于2013年9月就診。通過對豬場實施隔離、消毒、嚴格控制人員出入、治療、實驗室診斷等措施，有效地控制住了疾病的蔓延。通過病理剖檢、細菌分離檢測、PCＲ檢測，證實該病例為豬瘟病毒及多殺性巴氏桿菌混合感染引起。
2臨床癥狀
患豬呼吸困難，呈腹式呼吸，咳嗽，部分豬伴有腹瀉。病豬食欲減少或廢絕，體溫高熱(41～42℃)，心跳加快，可視黏膜發(fā)紺，腹側(cè)、耳根和四肢內(nèi)側(cè)皮膚出現(xiàn)紫斑，指壓不褪色，眼睛出現(xiàn)分泌物。有的豬表現(xiàn)胸膜肺炎癥狀(干咳、呼吸困難)，鼻孔流出漿性或膿性分泌物，初便秘，后腹瀉，消瘦無力，臥地不起。
3實驗室診斷
3．1病料處理
無菌采取病豬肺臟與肺門淋巴結(jié)加入無菌PBS液(pH值7．2)和適量滅菌石英砂研磨制成1∶5懸液，反復凍融3次后12000r/min離心30min，取上清液。并將初步純化的病毒經(jīng)30%和60%兩層蔗糖(wt/wt)不連續(xù)梯度離心，收集30%～60%蔗糖間的乳白色病毒帶于PBS中透析過夜，然后用聚乙二醇PEG－6000濃縮100倍，制成病毒濃縮液10mL，－80℃保存。分別取0．5mL用于DNA、ＲNA提取。試劑盒分別用10μL20mg/mL的蛋白酶K58℃孵育20min、65℃消化50min。再用QIAGENDNA提取試劑盒、QIAGENＲNA提取試劑盒進行基因組提取，提取的DNA、ＲNA基因組－20℃保存。對提取ＲNA用TaKaＲacDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于4℃保存，后進行ＲT－PCＲ檢測。
3．2病理剖解
發(fā)生呼吸系統(tǒng)癥狀豬全身黏膜、漿膜和皮下組織大量出血點，咽喉部及其周圍結(jié)締組織的出血性漿液浸潤。切開頸部皮膚時，可見大量膠凍樣淡黃或灰青色纖維素性漿液。全身淋巴結(jié)出血，切面紅色等全身出血性病變;支氣管內(nèi)部有少量泡沫，腹股溝淋巴結(jié)水腫、出血;有的保育豬具有纖維素性肺炎，肺臟有肝變區(qū)，周圍伴有氣腫;胸膜有纖維素性附著物。腹瀉豬嚴重脫水，腸道內(nèi)有多量黃色液體內(nèi)容物和氣體，腸黏膜充血、出血、腫脹，呈急性卡他性炎癥，以十二指腸最為明顯。其次為空腸和回腸，胃黏膜紅腫，表面附有多量黏液，內(nèi)有腥臭味和黃色凝乳塊，腸系膜淋巴結(jié)呈現(xiàn)出彌漫性小出血點，肝臟、腎臟有小凝固性壞死灶或小出血點。
3．3病原菌分離
無菌采取病豬的肺臟、肝臟組織進行觸片，取病料劃線接種于鮮血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h，觀察細菌的生長情況、菌落特征。挑取不同菌落形態(tài)細菌做革蘭染色、鏡檢，挑取菌落大小均為1mm左右、表面光滑、濕潤、呈露珠狀菌落，劃線分離培養(yǎng)，然后對分離培養(yǎng)的菌落進行瑞氏染色。純化的細菌提取基因組，試劑盒選用QIAGENDNA提取試劑盒。
3．4PCＲ擴增
根據(jù)臨床癥狀分別進行偽狂犬病毒(PＲV)、圓環(huán)病毒2型(PCV－2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PＲＲSV)、多殺性巴士桿菌(PM)的PCＲ檢測。
根據(jù)GenBank設計待測病原基因上下游引物，CSFV參考基因組NC_002657．1保守區(qū)、PＲＲSV參考基因組JX512910．1保守區(qū)、JEV參考保守序列IND－WB－JE5多聚蛋白基因KC879326．1、PＲV參考gll基因M17321．1設計、PCV－2參考OＲF2基因KC336417．1、巴氏桿菌(PM)通過保守序列KMT－1基因DQ871029．1設計引物，并通過Blast比對引物特異性。引物序列見表1。
CSFV、PＲＲSV及JEV為ＲNA病毒，進行ＲT－PCＲ擴增，用TaKaＲacDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板。反應體系為25μL體系:2×TaqPCＲMasterMix12．5μL，ddH2O8．5μL，上、下游引物各1μL，反轉(zhuǎn)錄的cDNA2μL。
擴增條件:95℃預變性5min;94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán);72℃延伸10min，4℃保存。
對PＲV、PCV－2、PM進行PCＲ擴增，擴增為25μL體系:2×TaqPCＲMasterMix12．5μL，ddH2O9．5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL。
擴增條件:95℃預變性5min;94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán);72℃延伸10min，4℃保存。
瓊脂糖凝膠電泳及成像:取5μLPCＲ擴增產(chǎn)物與5μL的6×LoadingBuffer，DL2000DNAMarker經(jīng)1．2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用BIO－ＲAD成像系統(tǒng)拍照觀察。
4結(jié)果
4．1細菌的分離及培養(yǎng)結(jié)果
以病危豬肺臟做組織觸片，進行革蘭染色，陰性，單個存在，形態(tài)一致，菌體近圓形，兩極著色不明顯。后進行瑞氏染色，可見典型兩極著色中間透明的短桿狀菌。
4．2PCＲ檢測結(jié)果
提取組織中總ＲNA的PＲＲSV、JEV病原檢測結(jié)果均為陰性;組織總DNA檢測的PＲV、PCV－2均為陰性;CSFV的PCＲ擴增陽性、多殺性巴氏桿菌KMT－1為陽性。
5治療
5．1緊急隔離
對體況健康受威脅豬緊急免疫接種豬瘟－藍耳病二聯(lián)弱毒疫苗。將病豬趕至同一圈舍，兩圈舍相隔20m。嚴格限制人員進出，控制人員流動，封鎖疫病豬舍通道，將豬場人員分為兩部分，一部分服務于患病豬舍，另一部分服務于健康豬圈舍，并嚴格控制兩部分人員交叉接觸。飼料、器具嚴格分開使用，并嚴格限制放置地點。人員進入圈舍后嚴格更換衣服，滅菌消毒。對死亡豬進行深埋處理。
5．2消毒
用1∶100菌毒殺消毒豬舍及周圍環(huán)境、進出通道，每天2次。圈欄、器具每2d用神五消毒液500倍液與金碘消毒劑600倍液稀釋交替消毒。人員進出更換衣服，并用1∶200菌毒殺噴灑衣物、鞋子。
5．3治療
病豬采用豬瘟－藍耳二聯(lián)高免血清按每千克體重0．05mL注射，每只每天2次，連用3d;地塞米松注射液1mL，每只每天1次，連用3d;抗生素用諾氟沙星與卡那霉素聯(lián)合用藥，肌肉注射，每千克體重諾氟沙星0．3mL、卡那霉素0．1mL，每天2次，連用10d;對血便、腹瀉豬肌肉注射止血敏，每只每天注射1mL，連用2d，并對其進行口服灌液，液體參入氯化鉀、維生素C、維生素B1、維生素B2;對食欲較差或拒食病豬，灌液中加入葡萄糖。
6小結(jié)
目前，豬瘟的很多臨床癥狀表現(xiàn)為非典型，僅憑臨床癥狀已無法確診，并極易造成誤診，混合感染在豬病中所占比例越來越大，更給獸醫(yī)臨床診斷帶來了很大的困難。所以必須經(jīng)過實驗室檢驗等綜合性診斷才能確診，面對混合感染愈加嚴重的情況一定要分清主次，以便采取綜合性防治措施，才能迅速控制疫情。
對于豬病的防治，一定要以預防為主，定期免疫接種重大疫病疫苗。對繼發(fā)性感染的病豬，一定要快速鑒別致病菌，并對其進行藥敏試驗，以便快速針對繼發(fā)感染細菌選擇敏感性抗生素，以防止濫用抗生素導致的抗生素失效。
要保持飼養(yǎng)場與外界隔離，以防止外來病原對本場牲畜侵襲。嚴格控制人員、車輛進出，進出要有消毒措施。對購進牲畜要進行隔離，以防止?jié)撛诓≡瓗腽B(yǎng)殖場，影響本場健康牲畜。飼養(yǎng)用的器具、水要嚴格消毒。人員應在工作中多注意牲畜情況，以做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療。
(重慶市畜牧技術(shù)推廣總站，朱燕;西南大學，胡艷;重慶市南岸區(qū)農(nóng)林水利局，黃曉玲)
