豬細(xì)小病毒（Porcineparvovirus）為細(xì)小病毒科（Family：Parvoviridae）細(xì)小病毒亞科（subFamily：Par-vovirinae）細(xì)小病毒屬（Genus：Parvovirus）成員。該病毒自1971年被國際病毒分類委員會(huì)（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）分類后，至今在病毒學(xué)的分類地位仍未變化。只是在1993年將其歸于新設(shè)立的細(xì)小病毒亞科（subFamily：Par-vovirinae）。至今，豬細(xì)小病毒仍屬于未分類病毒目（Virusfamiliesnotassignedtoanorder）。
豬細(xì)小病毒的初次分離一般選用豬腎原代細(xì)胞，也有見于使用PK-15細(xì)胞系和SK細(xì)胞。豬細(xì)小病毒為單股負(fù)鏈線性無囊膜的DNA病毒，病毒直徑約為20nm，在發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒之前，一度被認(rèn)為是豬群中最小且最簡單的DNA病毒。豬細(xì)小病毒感染可見于不同日齡的豬群，也有野豬感染豬細(xì)小病毒的研究報(bào)道。
本研究設(shè)計(jì)針對(duì)豬細(xì)小病毒病毒VP2基因的特異性引物，通過PCR方法對(duì)分離的細(xì)小病毒株進(jìn)行鑒定，證實(shí)分離到一株豬細(xì)小病毒，現(xiàn)報(bào)道如下。
1材料與方法
1.1病料收集與處理采集福建某豬場初產(chǎn)母豬流產(chǎn)胎兒的腎臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)組織，剪碎后用研缽研磨處理，按照1:5比例加入含雙抗（100IU/mL）的滅菌生理鹽水進(jìn)行勻漿，反復(fù)凍融4次，6000r/min離心30min后吸取上清液，凍存?zhèn)溆谩?/div>
1.2試驗(yàn)試劑2×TransTaq-TPCRSuperMix、蛋白酶K、RNaseA、克隆載體和JM109感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RM-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibico公司；常規(guī)化學(xué)試劑和藥品均購自上海生工公司。
1.3病毒接種將1.1項(xiàng)處理好的病料乳劑經(jīng)0.22um過濾器過濾后，按照1.0%的劑量接種仔豬原代腎細(xì)胞，37℃溫箱中培養(yǎng)24h，棄除細(xì)胞培養(yǎng)液上清，換成不含胎牛血清的RM-1640培養(yǎng)基，37℃溫箱中連續(xù)培養(yǎng)，再連續(xù)觀察5d。待接種的豬原代腎細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收獲細(xì)胞液。將收獲的細(xì)胞毒液在仔豬原代腎細(xì)胞上繼續(xù)傳3代，并檢測其1.0%豚鼠紅細(xì)胞血凝價(jià)。
1.4病毒DNA的提取采用經(jīng)改良的蛋白酶K乙醇沉淀DNA法，簡要步驟如下：取細(xì)胞毒液490μL，往其中加入1%SDS10μL、蛋白酶K（20mg/mL）2μL后，于56℃水浴2h；往其中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（體積比為25:24:1），震蕩后混勻，室溫靜置10min；12000r/min離心10min；小心吸取上清后再加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（體積比為25:24:1），震蕩后混勻，重復(fù)離心操作一次；取上清后加入100μLNaAc（pH5.2，3M）和50μL異戊醇沉淀核酸，-20℃靜置2h；12000r/min離心10min，用70%乙醇和無水乙醇各沉淀核酸一次；最后加入50μL滅菌去離子，37℃水浴10min后，置于-20℃?zhèn)溆谩?/div>
1.5PCR鑒定利用引物設(shè)計(jì)軟件OLIGO設(shè)計(jì)針對(duì)豬細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP的特異性檢測引物，上游引物序列為：5'-AGACTCAATACAAACAGGAC-TACA-3'；下游引物：5'-TTTAGTGGTGCCT-GTTGATTAAAT-3'，目的片段大小預(yù)計(jì)為558bp，引物由上海生工公司合成，引物合成后用滅菌去離子水稀釋至終濃度10pmol備用。以1.4項(xiàng)中提取的豬細(xì)小病毒DNA為PCR模板進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增體系為50μL，其中2×PCRMix預(yù)混液25μL、上下游引物（10pmol）各2μL、DNA模板1μL，補(bǔ)充滅菌去離子水至終體積50μL。反應(yīng)條件為94℃5min預(yù)變性后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94℃50s、54℃30s、72℃40s，40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5μL，在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳。經(jīng)膠回收試劑盒切膠回收純化后與T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)陽性鑒定后送由上海生工公司進(jìn)行序列測定。
1.6序列分析將1.5項(xiàng)的測序結(jié)果經(jīng)拼接后進(jìn)行BLAST數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，與GeneBank中登錄的豬細(xì)小病毒相關(guān)基因序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。
2結(jié)果
2.1病毒分離病料接種豬原代腎細(xì)胞，傳代5代后，第5代接種豬原代腎細(xì)胞84h后開始見有細(xì)胞病變，病變細(xì)胞呈現(xiàn)為圓縮、拉網(wǎng)絲狀、最后見溶解脫落。經(jīng)自制的1.0%新鮮豚鼠紅細(xì)胞測定，第5代的血凝價(jià)可達(dá)27。
2.2PCR鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，見有目的條帶擴(kuò)增，大小約為500bp，符合試驗(yàn)預(yù)期（見圖1）。
2.3克隆序列基因分析將測序結(jié)果通過美國國立生物技術(shù)信息中心（NationalCenterofBiotechnologyInformation，NCBI）數(shù)據(jù)庫利BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果同源性最高序列的均為豬細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP目的基因。克隆獲得序列和德國健康豬體內(nèi)分離的豬細(xì)小病毒80T株（GenBank號(hào)為KC296746）和37T株（GenBank號(hào)為KC296744）核苷酸同源性均最高，均高達(dá)99.7%。將測序拼接結(jié)果和GenBank中登錄的豬細(xì)小病毒代表株基因序列繪制該基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，可見本試驗(yàn)豬細(xì)小病毒分離株和德國健康豬體內(nèi)分離的豬細(xì)小病毒80T株和37T株處于同一遺傳進(jìn)化分支（見圖2）。
3討論
豬感染豬細(xì)小病毒（PPV）可導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)和死胎等，其臨床表現(xiàn)癥狀較難與其他產(chǎn)檢致病病原（如豬藍(lán)耳病病毒和豬瘟病毒等）特征相區(qū)別。對(duì)于豬細(xì)小病毒的分離，至今還是研究該病的基礎(chǔ)，主要采集的病料多為流產(chǎn)死胎肝與腸系膜淋巴結(jié)等組織，接種特異性細(xì)胞（如豬腎細(xì)胞、PK-15等），可獲得較高的病毒分離率。
目前關(guān)于豬細(xì)小病毒的診斷方法有較多研究報(bào)道，除經(jīng)典的血凝和血凝抑制試驗(yàn)、PCR法以外，近年來還有LAMP法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和IPMA方法等報(bào)道。本研究獲得針對(duì)VP基因設(shè)計(jì)的引物，經(jīng)擴(kuò)增后的序列與德國豬細(xì)小病毒80T株、豬37T株核苷酸同源性均最高，均高達(dá)99.7%。繪制其相互之間系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可以看出，本試驗(yàn)豬細(xì)小病毒分離株與從德國健康豬體內(nèi)分離的豬細(xì)小病毒80T株及37T株處于同一遺傳進(jìn)化分支。
（福建省泉州市洛江區(qū)農(nóng)業(yè)水務(wù)局，林川）
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