自2010年以來，產(chǎn)房初生仔豬腹瀉已經(jīng)持續(xù)發(fā)生了多年，其時間之長、地域跨度之大和死亡率之高給業(yè)界造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]，導(dǎo)致很多規(guī)?；B(yǎng)豬場常年處于虧損的狀態(tài)，企業(yè)老板、經(jīng)理人和員工“談瀉色變”。
從2013年底開始，美國許多州陸續(xù)發(fā)生腹瀉，截至2014年4月，共波28個州，仔豬死亡高達(dá)600萬之多，給美國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，歐盟甚至規(guī)定暫時禁止從美國進(jìn)口豬肉。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，美國目前已有超過57%的母豬場發(fā)生了流行性腹瀉。
面對腹瀉的肆虐，廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心同揚(yáng)翔地方豬研究院合作，數(shù)年來不間斷地對臨床上產(chǎn)房仔豬腹瀉的樣品進(jìn)行檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果對發(fā)病豬場進(jìn)行各種防控和治療方式的探索。
1試驗(yàn)材料
1.1樣品來源
2011年12月至2014年4月，由廣西多個縣市規(guī)模養(yǎng)豬場提供的共200多份腹瀉樣品。
1.2主要試劑
總RNA抽提試劑Trizol：購自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、dNTPs、rTaq：購自TaKaRa；豬瘟抗原檢測試劑盒和偽狂犬病野毒抗體檢測試劑盒：購自美國愛德士生物科技公司。胰蛋白胨大豆瓊脂（TryptoneSoyaAgar，TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）：購自美國Becton，Dick－insonandCompany；麥康凱瓊脂：購自中國檢驗(yàn)檢疫局科學(xué)研究院北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；革蘭氏染色液：購自杭州天和微生物試劑公司；無支原體牛血清：購自杭州四季青公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）：購自中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司。
1.3培養(yǎng)基的配置
1.3.1TSA固體培養(yǎng)基準(zhǔn)確稱取TSA40g，加入1000mL蒸餾水，充分搖勻后116℃高壓蒸氣滅菌15min，水浴冷卻至60℃，按6%比例加入無支原體牛血清，再加入0.6%過濾除菌的1%NAD，充分搖勻后倒入平皿。
1.3.2麥康凱培養(yǎng)基準(zhǔn)確稱取麥康凱瓊脂55g，加入1000mL蒸餾水，充分搖勻后116℃高壓蒸氣滅菌20min，水浴冷卻至60℃，充分搖勻后倒入平皿。
2試驗(yàn)方法
2.1病原的檢測
運(yùn)用PCR法檢測圓環(huán)病毒2型和偽狂犬病病毒，RT-PCR法檢測藍(lán)耳病病毒、豬瘟病毒、傳染性胃腸炎病毒、流行性腹瀉病毒、輪狀病毒、庫布病毒和博卡病毒，引物略。
2.2病原菌的分離、鑒定和培養(yǎng)
分離：無菌操作，從豬肺臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、腿關(guān)節(jié)和腦組織等病料中取樣，于加有NAD的TSA固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)8~72h。
鑒定：挑取單個菌落的1/2做觸酶試驗(yàn)，剩下的1/2按常規(guī)革蘭氏染色法染色后用光學(xué)顯微鏡觀察。
培養(yǎng)：挑取單個菌落劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)8~72h，觀察培養(yǎng)結(jié)果。
2.3臍帶血的采集和檢測
取干凈的青霉素瓶，滅菌烘干后備用；將初生小豬的“臍帶血”盡可能多地擠到備用的青霉素瓶中，4℃保存送至實(shí)驗(yàn)室待檢。按常規(guī)的抽提方法抽提DNA和RNA模板后，采用相應(yīng)的PCR和RT-PCR方法進(jìn)行檢測。
2.4腹瀉防控方案
2.4.1機(jī)械清理、消毒等保守療法選擇按照機(jī)械清理、火焰燒烤和各種消毒方式治療和防控腹瀉的豬場，隨機(jī)調(diào)查5家以上、母豬規(guī)模不少于300頭的豬場。
2.4.2返飼[3]返飼方法：取嚴(yán)重腹瀉后8~16h之間的仔豬處死，解剖后取1kg腸子加入預(yù)冷的生理鹽水，用組織勻漿機(jī)絞碎處理，之后補(bǔ)足生理鹽水至用量為2L。隨后加入適量白糖改善口感，并加入抗生素（阿莫西林或者青霉素+鏈霉素，按保健劑量添加），預(yù)防其它細(xì)菌感染。每次用50g左右混合腸溶液給懷孕60~95d的母豬灌服，每天1次，連用3~5d，直到母豬出現(xiàn)腹瀉后，停止飼喂。若返飼多次后仍沒有母豬出現(xiàn)腹瀉，可考慮加大用量。隨機(jī)調(diào)查5家以上、母豬規(guī)模不小于300頭的采用返飼方案的豬場。
2.4.3本小組方案本小組從2010年以來，成功處理案例60起以上。方案：選取豬場初生仔豬的臍帶血和未吃初乳弱仔進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，有針對性地對場內(nèi)母豬加免相應(yīng)的病毒性疫苗。經(jīng)產(chǎn)母豬加免2次，免疫時間為產(chǎn)前21d和產(chǎn)前7d；頭胎母豬加免3次，免疫時間為產(chǎn)前21d、產(chǎn)前14d和產(chǎn)前7d；仔豬根據(jù)情況，口服益生菌；環(huán)境使用易速康干粉進(jìn)行消毒。隨機(jī)調(diào)查5家以上、母豬規(guī)模不小于300頭的采用本小組方案的豬場。
2.4.4腹瀉疫苗從臨床上隨機(jī)調(diào)查5家以上、母豬規(guī)模不小于300頭的具有腹瀉疫苗使用史的豬場，疫苗來源：市售或者中試產(chǎn)品。
3結(jié)果與分析
3.1病毒性傳染性因素
腹瀉問題發(fā)生時，檢測出的病毒種類主要有以下幾種：腸炎型豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、博卡病毒和庫布病毒。從表1和圖1可以看出，圓環(huán)病毒2型從2012年以來檢出率居高不下，2013年散戶高達(dá)70%以上；藍(lán)耳病病毒的普通株和變異株也有一定的檢出率，規(guī)模豬場的藍(lán)耳病病毒普通株檢出率比散戶要高得多，但變異毒株的檢出率卻相差不大；偽狂犬病病毒這幾年一直都可檢測到，且散戶的檢出率明顯高于規(guī)模豬場；豬瘟病毒的檢出率不是很高。
從表2和圖2可以看出，腹瀉相關(guān)病原中，流行性腹瀉病毒的檢出率居高不下，且每年都變化不大、集中在60%以上；庫布病毒的檢出率呈上升趨勢，且規(guī)模豬場和散戶的檢出率均較高；博卡病毒、傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒的檢測率均較低。
3.22013年全年臍帶血檢測結(jié)果
臍帶血是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液，含有正常血液的所有成分，如紅血球、白血球、血小板和血漿，還含有可以重建機(jī)體造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的造血干細(xì)胞，可用于造血干細(xì)胞移植以及治療多種疾病。臍帶血是連接母子營養(yǎng)、遺傳信息等的重要通道，通過檢測臍帶血中存在的病原，可以得知經(jīng)由母豬傳給小豬的疾病。鑒于以前母豬臍帶血的研究較少，本試驗(yàn)小組建立了臍帶血檢測疾病病原的方法。
從表3和圖3可以看出，2013年臍帶血檢測結(jié)果中，博卡病毒、圓環(huán)病毒2型、藍(lán)耳病病毒變異株和流行性腹瀉病毒的檢出率均較高，這與上述對近幾年腹瀉病料的檢測結(jié)果有很高的相似性。此外，還從臍帶血中檢測出了藍(lán)耳病病毒普通株、偽狂犬病病毒和細(xì)小病毒。
3.3細(xì)菌性因素
仔豬黃白痢曾經(jīng)是產(chǎn)房中重要的腹瀉原發(fā)性疾病。在此次流行的產(chǎn)房仔豬腹瀉中，本小組對腹瀉小豬的細(xì)菌性病原進(jìn)行了監(jiān)控，從表4和圖4可知，大腸桿菌仍然是分離率最高的細(xì)菌性病原，此外還分離到了金黃色葡萄球菌和鏈球菌以及少量的巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌。
3.4各種控制方案的臨床效果
對各種措施的臨床效果進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)：1）不作處理和只作常規(guī)處理的豬場，死亡率很高腹瀉持續(xù)時間長，有的甚至持續(xù)了2年，常規(guī)治療效果不明顯；2）做返飼處理的豬場，有的在短時間內(nèi)收到了一定的療效，有的效果不明顯，重復(fù)發(fā)生后治療效果不佳；3）使用腹瀉苗的豬場臨床效果不一致，跟蹤發(fā)現(xiàn)，有些豬場會出現(xiàn)某次有效控制住一段時間后又持續(xù)發(fā)生的現(xiàn)象；4）本小組方案（見2.4.3）視臍帶血檢測結(jié)果給予處理方案的豬場，都能得到有效的控制，只是從開始處理到完全控制所需的時間長短不同（表5）。
4討論與防控思考
4.1從檢測結(jié)果看豬場產(chǎn)房初生仔豬腹瀉的嚴(yán)峻性
從母豬、中大豬和保育豬的腹瀉糞便樣品中（本試驗(yàn)未體現(xiàn)），大多都可檢測出流行性腹瀉病原，有些豬場還繼發(fā)大腸桿菌感染。從仔豬腹瀉的病原檢測結(jié)果來看，病毒性病原有圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、藍(lán)耳病病毒、流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、庫布病毒和博卡病毒，并且各豬場的病原檢出率和病原種類存在很大的差異，其中流行性腹瀉病毒和圓環(huán)病毒2型的檢出率較高，特別是腹瀉仔豬；而細(xì)菌性病原方面，主要是繼發(fā)感染的大腸桿菌，但也有檢測到鏈球菌和金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌這幾年的臨床檢出率升高，值得關(guān)注。
4.2從臍帶血檢測結(jié)果分析疾病的傳播
本小組是國內(nèi)最早將臍帶血作為檢測材料用于分析腹瀉病因的。從臍帶血的檢測結(jié)果可以看出，母豬通過臍帶血向仔豬傳播了大量腹瀉相關(guān)病原。臍帶本是營養(yǎng)和信息物質(zhì)傳遞的通道，由于胎盤屏障的存在，正常情況下，健康豬的臍帶血中是檢測不到病毒和抗體的。根據(jù)本小組對2013年臍帶血數(shù)據(jù)的分析，當(dāng)前規(guī)?；i場由母豬垂直傳播給仔豬的病原有博卡病毒、圓環(huán)病毒2型、藍(lán)耳病病毒變異株、流行性腹瀉病毒、藍(lán)耳病病毒普通株、偽狂犬病病毒和細(xì)小病毒，應(yīng)引起關(guān)注。
4.3從病原檢測結(jié)果對臨床腹瀉防控的思考
從臨床送檢的病料中，檢測到的病原種類繁多，各個豬場存在的病原亦有所不同，這種情況下，給腹瀉的控制帶來了很大的挑戰(zhàn)。從流行病學(xué)方面來看，流行性腹瀉病毒和圓環(huán)病毒2型的檢出率最高，但在腹瀉的臨床防控上，很少有專家把圓環(huán)病毒2型作為防控的首要病原之一。這是否是臨床上單獨(dú)使用流行性腹瀉疫苗效果不佳或腹瀉反復(fù)發(fā)作的原因，值得大家思考。
在臨床防控上，可以先針對圓環(huán)病毒2型和流行性腹瀉病毒進(jìn)行統(tǒng)一防控，但對個別頑固性腹瀉的規(guī)?；i場，也要重視腹瀉其他相關(guān)病原的檢測工作。
4.4臨床方案實(shí)施的療效分析
為何傳統(tǒng)方法不易控制此次腹瀉，疫苗效果不佳：前些年發(fā)生腹瀉后，母豬和中大豬1周后多會自然康復(fù)，仔豬也沒有這么高的死亡率。此次腹瀉，有些豬場反復(fù)發(fā)作，采取了很多措施，也難以收到很好的療效，原因何在？主要是不同場引起腹瀉的病原有所差異，普遍采取的措施跟本場的病原之間沒有很好的對應(yīng)。傳統(tǒng)的返飼等針對流行性腹瀉病原有很好的效果，而此次腹瀉病原復(fù)雜，流行性腹瀉只是原因之一，單一的圓環(huán)病毒2型也可造成仔豬嚴(yán)重的腹瀉癥狀。
為何不贊成返飼：歐美、東南亞等國家的某些專家比較喜歡用返飼來處理產(chǎn)房仔豬的腹瀉，但本小組不贊成使用該法來控制本國的腹瀉。因?yàn)椋趯?shí)驗(yàn)室的檢測中，發(fā)現(xiàn)了臍帶血中含有大量的病原，這些病原通過母豬傳給仔豬，用仔豬的病料進(jìn)行返飼，無異于將病毒擴(kuò)散至全群，且返飼主要針對流行性腹瀉等腸道病原，此次腹瀉病原復(fù)雜，單獨(dú)用返飼收不到良好的療效。
為何返飼豬場會反復(fù)發(fā)作：返飼后，母豬產(chǎn)生了一定的流行性腹瀉病毒的抗體，對仔豬有一定的保護(hù)，但抗體滴度不高，而病毒持續(xù)在豬舍豬群中存在，同時還有其他病原的持續(xù)感染，因此，腹瀉容易在一個豬場持續(xù)發(fā)生，防控腹瀉是一個長期的過程。
為何頭胎母豬容易發(fā)生腹瀉，防控腹瀉需從母豬抓起：相對于經(jīng)產(chǎn)母豬，頭胎母豬體內(nèi)很多抗體的產(chǎn)生量和滴度都比較低，抗體的種類也比較少，因此，對于環(huán)境中病原的攻擊，頭胎母豬更易產(chǎn)生腹瀉。之所以防控腹瀉要從母豬抓起，是因?yàn)楦篂a發(fā)生后，病原大量存在于母豬體內(nèi)和周圍環(huán)境中，并通過環(huán)境、母豬的產(chǎn)道分泌物、臍帶血、甚至是奶水傳染給仔豬。本小組在母豬奶水中檢測出大量的流行性腹瀉病毒。因此，控制腹瀉，首先要提高母豬體內(nèi)的抗體水平，從而阻斷母體傳播，同時母源抗體的攝入，對仔豬提供了保護(hù)作用。
為何產(chǎn)房腹瀉發(fā)生后，開始時發(fā)病日齡越來越小，而后發(fā)病日齡越來越大：有些豬場，先是產(chǎn)后1~3日齡的仔豬出現(xiàn)頑固性腹瀉，發(fā)病率為50%~100%，死亡率為80%~100%，即使不加處理或是只做一些常規(guī)的消毒處理工作，產(chǎn)房腹瀉都暫停一段時間。但隨著時間的推移，腹瀉疫情再次復(fù)發(fā)，多為10日齡以上仔豬發(fā)病，可通過保暖、消毒、人工補(bǔ)液等措施將死亡率降低。有的豬場規(guī)律性不是很明顯，有的母豬出現(xiàn)腹瀉癥狀、有的母豬腹瀉癥狀不明顯。本小組分析這可能是由于病原在產(chǎn)房蓄積造成的。
造成母豬免疫抑制的原因：毫無疑問，當(dāng)前，包括仔豬腹瀉在內(nèi)的一系列疾病的發(fā)生與母豬的免疫抑制直接相關(guān)。那么引起母豬免疫抑制的因素有哪些？這些因素中，飼料中的霉菌毒素是飼源性的，需要嚴(yán)把飼料原料關(guān)，定期檢查飼料儲存、運(yùn)送、管道和飼喂設(shè)備等，特別是兩廣地區(qū)，天氣潮濕，飼料很容易在管道中和接口處霉變。引起免疫抑制的疾病因素中，需要關(guān)注藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病、細(xì)小病毒病、偽狂犬病和豬瘟等。藍(lán)耳病病毒和圓環(huán)病毒2型已經(jīng)成為豬場的常見病原，需要引起足夠的重視；細(xì)小病毒和圓環(huán)病毒2型間有協(xié)同作用，近年來，隨著圓環(huán)病毒2型感染率的增加，細(xì)小病毒的帶毒率也會越來越高；偽狂犬病病毒變異株[5]雖然還未造成大面積流行，但也感染了很多豬場，母豬帶毒率上升，同樣需要關(guān)注；非典型豬瘟在母豬體內(nèi)持續(xù)帶毒是一個老話題，仍在一定范圍內(nèi)影響著一些豬場，需要靠免疫、淘汰來解決。
散養(yǎng)戶控制產(chǎn)房腹瀉比較有效的辦法：在臨床上控制腹瀉的過程中，大部分散戶并不重視隔離和消毒，更談不上重視完整和健全的生物安全，絕大部分豬場亦不重視檢測工作，被動地去治療發(fā)病后的仔豬，往往收效甚微。本小組在實(shí)際控制中，建議發(fā)生產(chǎn)房仔豬腹瀉的豬場，將重胎母豬直接轉(zhuǎn)入大欄產(chǎn)仔，轉(zhuǎn)入前對大欄進(jìn)行消毒并做好保溫工作。使用干粉帶豬消毒，并防止母豬壓死新生仔豬。將產(chǎn)房空置出來，往往能收到較好的療效。
生物安全、水源和管理方面：對于規(guī)模化豬場而言，無論防控何種疾病，都需要做好生物安全防控，其中外圍生物安全至關(guān)重要，所有的人流、物流和車流都需要布置合理、規(guī)范到位，且需要有良好的監(jiān)督和回饋機(jī)制。在這里值得提醒的是，在生物安全防控方面，臭氧發(fā)生器可以對進(jìn)入豬場的物資進(jìn)行很好的消毒，很多大規(guī)模的豬場均已使用，效果很好，值得推廣。在實(shí)際監(jiān)測中，某些豬場水源的細(xì)菌超標(biāo)現(xiàn)象時有發(fā)生，有些豬場的大腸桿菌甚至超標(biāo)1000多倍，同時還有其他細(xì)菌，因此，定期監(jiān)測水質(zhì)也十分重要。另外，在生產(chǎn)過程中，母乳、冷熱應(yīng)激、飼養(yǎng)管理以及產(chǎn)房內(nèi)有害微生物的種類和數(shù)目等也是影響產(chǎn)房仔豬腹瀉的重要因素，因此，在保證全進(jìn)全出的基礎(chǔ)上，延長空欄消毒時間，規(guī)范產(chǎn)房操作，嚴(yán)格規(guī)范各種用品和物資的區(qū)域，加強(qiáng)干粉消毒的力度，等等，都顯得十分重要。
綜上所述，在一定時期內(nèi)，產(chǎn)房仔豬腹瀉還會在一定區(qū)域內(nèi)危害各種類型的豬場，從業(yè)者需要切實(shí)分析清楚危害本場的病原是什么，然后根據(jù)病原制定合理的控制方案；同時做好豬場尤其是產(chǎn)房的生物安全工作，對豬場的水源、飼料、欄舍和工具等嚴(yán)格把控，提高豬場工作人員的疾病防控意識等。一言之，控制腹瀉的根本在于如何處理母豬，緩解腹瀉的辦法在于控制仔豬和調(diào)節(jié)環(huán)境。
（廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，胡巧云，；廣西揚(yáng)翔地方豬創(chuàng)新研究院，喻正軍，汪雪，陳基萍，李聰）
