1 試驗材料
1.1 病例來源
2013年10月，常州市武進區(qū)動物疫病預防控制中心接診本市某豬場病例。
1.2 病料
取40日齡病死斷奶仔豬的肺、脾和淋巴結(jié)。
1.3 引物
PRRSV特異性引物，HCV特異性引物，隨機引物（100mmol/L）。
1.4 試劑
RNA提取試劑盒，雙抗生理鹽水（青霉素、鏈霉素各1000IU/ml），dNTP（100mmol/L），Taq（DNA聚合酶），AMV（反轉(zhuǎn)錄酶），RNA酶抑制劑（RNasei），ddH2O（雙蒸水），5×AMVBuffer，10×TaqBuffer。
1.5 器械
玻璃研磨器，平皿，組織剪，超凈工作臺，酒精燈，可調(diào)微量移液槍和tip頭，離心機，離心管，42℃水浴鍋，PCR管，1.5ml指形管，冰箱，PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)，電泳儀。
2 方法
2.1 病理剖檢
剖檢3頭40日齡的病死仔豬。
2.2 RT-PCR試驗
2.2.1 準備
將玻璃研磨器煮沸消毒15min。
2.2.2 研磨
在超凈工作臺上，將病料組織剪取3～5g，置于玻璃研磨器中，按1∶5體積加入雙抗生理鹽水，研磨成勻漿，37℃靜置30min。
2.2.3 收取病毒原液
將勻漿倒入離心管中，3000rpm10min，收取上清液倒入離心管中再次離心（8000rpm10min）。
2.2.4 RNA提取
用RNA提取試劑盒提取組織總RNA。取上清250ml加入trizol試劑500μl，混勻放置10min；用1ml針筒，26-G號（直徑4.5）針頭抽吸勻漿液2次以剪切基因組DNA，然后直接從針筒中將樣品轉(zhuǎn)移到無菌1.5mlEppendorf管中；加入100μl氯仿/異戊醇（24∶1），劇烈震蕩混勻30s；臺式離心機上，12000rpm，室溫離心5min；將上清液（約450ul）小心轉(zhuǎn)移到無菌1.5mlRNase-free離心管里，加入150μl無水乙醇，混勻；將上述溶液全部轉(zhuǎn)移到套放于2ml收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，室溫放置2min，8000rpm離心1min；小心取出柱子，棄去收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，加入450ulRPESolution，10000rpm，室溫離心30s；重復上一步驟一次；小心取出柱子，棄去收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，10000rpm，室溫離心15s；小心取出柱子，放入無菌Rnase-freed的1.5ml離心管中，在柱內(nèi)膜的中央小心加入50μlDEPC-H2O，55℃～58℃放置2min（室溫放置產(chǎn)率約低20%左右）；10000rpm，室溫離心1min。收集管內(nèi)的溶液為RNA樣品，可立即使用或者-70℃保存。
2.2.5 反轉(zhuǎn)錄（RT）
將提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，具體操作步驟詳見表1。將表格中的反應物加入PCR管中，然后放入42℃水浴鍋（置90min）中，置（-20℃）保存?zhèn)溆谩?/div>
2.2.6 PCR擴增
取反轉(zhuǎn)錄好的cDNA進行PCR擴增（primers為PRRSV特異性引物），擴增步驟詳見表2。將表格中的系列反應物加入PCR管中，按照下述的反應條件進行擴增。
2.2.7 反應條件
從試驗的第2步到第4步的3個環(huán)節(jié)需要進行30次循環(huán)，詳見表3。
2.2.8 PCR擴增
取反轉(zhuǎn)錄好的cDNA進行PCR擴增（primers為HCV特異性引物），詳見表4。將表格中的系列反應物加入PCR管中，按照下述的反應條件進行擴增。
2.2.9 反應條件
第2步到第4步的3個環(huán)節(jié)需要進行30次循環(huán)。PCR擴增的反應條件詳見表5。
2.3 電泳
1%瓊脂糖凝膠的配制（0.3g瓊脂糖+30ml電泳緩沖液，微波爐煮沸3次冷卻至60℃左右時，加入2.0μl溴化乙錠，混勻倒入模具中插入梳子）；待凝膠凝固后，拔出梳子，置電泳槽中；取PCR產(chǎn)物15μl加入6倍的loadingbuffer3μl混勻，加樣；進行電泳（電壓：80V維持50min）。
3 結(jié)果
3.1 病史及流行病學調(diào)查結(jié)果
斷奶仔豬的發(fā)病日齡在25～90日齡之間，且發(fā)病率和死亡率都很高，其中，以50～90日齡仔豬發(fā)病率和死亡率最高，分別達到100%；有3頭母豬（有高致病性藍耳病免疫史）出現(xiàn)繁殖障礙性疾病；由于健康狀況不穩(wěn)定，該場還沒有對苗豬群接種過PRRS疫苗。
3.2 剖檢結(jié)果
表現(xiàn)為心肌變軟，肺臟彌漫性出血，或心尖肉變；部分有肝出血，膽囊腫大；脾臟輕度腫大，有少量梗死；腎腫大，有大量出血點或先天性發(fā)育不良；全身淋巴結(jié)水腫或周邊出血；1/3出現(xiàn)胃潰瘍，腹部皮下水腫。
4 小結(jié)與討論
（1）根據(jù)病史及流行病學調(diào)查、病理變化及實驗室診斷結(jié)果陽性，可確診斷奶仔豬的死亡是PRRSV與HCV混合感染所致。
（2）該場在2次引進種母豬時，未采取任何關于PRRSV的相關檢測；并且該批豬群也未接種過PRRS疫苗，僅對豬群接種了豬瘟、豬細小病毒病、偽狂犬病、流行性乙型腦炎等疾病疫苗，導致對PRRS的漏防，使PRRSV容易在豬群內(nèi)部傳播；所以由此可判定，該場斷奶仔豬暴發(fā)PRRS的病原可能是由于從外地引進的種母豬帶入的，這也是導致斷奶仔豬暴發(fā)PRRS的根本原因。
（3）雖然該場對斷奶仔豬接種過豬瘟滅活疫苗，但由于PRRSV可引起豬免疫抑制，當仔豬感染PRRSV后：一方面，造成斷奶仔豬機體的免疫抑制，使哺乳仔豬在28日齡斷乳即使注射豬瘟疫苗后，機體不能或很少對抗原產(chǎn)生免疫應答，導致豬瘟疫苗免疫失敗，不能發(fā)揮保護作用，使得斷奶仔豬缺乏豬瘟抗體保護，而感染豬瘟，使死亡率上升。另一方面，斷奶仔豬感染PRRSV后機體抵抗力下降，也容易引起其他病原體的繼發(fā)感染。由于PRRS對養(yǎng)豬業(yè)的危害巨大，所以應加強對該病的重視，免疫接種PRRS疫苗，采取科學有效的措施，以控制住PRRS在武進區(qū)的蔓延，以實現(xiàn)消滅該病為最終目的。
（常州市武進區(qū)動物疫病預防控制中心，王建，陳丹清；常州市武進區(qū)，蔣紅紅，周波）
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